Разработка метода получения растений, устойчивых к солям свинца.
Артемьев Ю.В.
Московский государственный гуманитарный университет им. М.А.Шолохова.
yuri-artemiev@yandex.ru
Фиторемедиация – эффективный и экономически выгодный способ борьбы с загрязнением окружающей среды. Использовать для фиторемедиации бобовые растения выгоднее в том плане, что азотфиксирующие бактерии-симбионты бобовых, позволяют помимо очистки еще и повышать плодородие почв. Гипераккумулятором солей свинца считается, также, кукуруза. Для повышения эффективности фиторемедиации необходимо получить растения, устойчивые к высоким концентрациям загрязнителей в почве. Учитывая тот факт, что устойчивость к ионам тяжелых металлов обусловлена, в основном, клеточными механизмами, представляется перспективным использование метода клеточной селекции для получения устойчивых клеточных линий и растений.
Целью нашей работы является получение с помощью методов биотехнологии растений люцерны и кукурузы, устойчивых к нитрату свинца.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1-й год:
- на основании изучения литературы по загрязнению почв определить диапазоны концентраций ионов тяжелых металлов – свинца и кадмия в почве;
- провести оценку фитотоксичности тяжелых металлов;
- на примере 3 практически важных сортов люцерны оптимизировать условия культивирования каллусных культур и регенерации растений;
2-й год:
- разработать условия клеточной селекции для отбора устойчивых к ионам ТМ каллусных линий люцерны;
- из отобранных каллусных линий, толерантных к ионам ТМ, получить растения–регенеранты, устойчивые к этим токсикантам;
- проверить сохранение признаков устойчивости и толерантности к ТМ в следующих поколениях выделенных регенерантов.
1. В работе были использованы практически важные виды люцерны Medicago varia (Пастбищная 88), Medicago glutinosa (П-66) и Medicago falcata (Т-425), а также линии кукурузы А188 и R91.
2. Большинство выбросов токсических веществ сосредотачивается в почве, где происходит их депонирование.
Среди техногенных факторов наибольшую опасность представляют соли тяжелых металлов. Содержание тяжелых металлов в почвогрунтах превышает ПДК в 5-100 раз. Городские почвы вблизи промышленных объектов и автотранспортных магистралей имеют сверхвысокие концентрации таких тяжелых металлов, как медь цинк, никель, свинец, кобальт, кадмий. В промышленном Юго-Восточном округе Москвы концентрация ТМ в почве колеблется от 30 до 1500 мг/ кг. По способностям связывать тяжелые металлы почвы образуют следующий ряд: серозем > чернозем > дерново-подзолистая почва. Особую опасность для растений представляет аккумуляция подвижных форм ТМ.
Площадь сильно загрязненных почв в Москве постоянно увеличивается, а площадь с низким уровнем загрязнения, за последние 15 лет, сократилась более чем в 2 раза.
3. Для определения чувствительности растений к солям ТМ анализировали энергию прорастания семян, длину проростков и прирост каллусных тканей на средах c нитратом свинца в концентрациях 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2%. По прорастанию семян из исследованных видов люцерны в интервале от 0 до 0,8% соли наиболее устойчивым был вид Medicago glutinosa (П-66). Доза более 1% Pb(NO3)2 оказалась летальной. Полулетальной концентрацией для П-88 и Т-425 оказалась 0,4%, для П-66 – 0,6%.
Ось У – процент прорастания.
Ось Х – концентрация нитрата свинца в растворе.
Всхожесть люцерны в зависимости от концентрации нитрата свинца в растворе.
Сравнение трех сортов. (П-88 M. varia, П-66 M. glutinosa, Т-425 M. falcatа).
3. Размер 5-тидневных проростков у всех сортов падает при концентрации 0,4% до 20% по сравнению с контрольными растениями. Причем П-66 имея хорошую энергию прорастания имеет самый маленький относительный размер проростков. Из гипокотилей и семян изучаемых линий люцерны на среде Гамборга (В5) были получены каллусные культуры. Первичный каллус получали на агаризованной среде Гамборга, содержащей 30г/л сахарозы, 500мг/л гидролизата казеина и 7 г/л агар-агара. Концентрация 2,4-Д варьировали в пределах 2-4 мг/л. Семена предварительно стерилизовали коммерческим отбеливателем «Белизна». Простерилизованные семена раскладывали в чашки Петри на поверхность агаризованной среды (по 30 семян чашку) и культивировали при температуре 26 и влажности 70% на свету интенсивностью 2000 лк при длине светового дня 16 час. Через 12 дней культивирования определяли % каллусообразования, как отношение количества эксплантов образовавших каллус к общему количеству эксплантов. 80-90% эксплантов образовывали каллус. Каллус из гипокотилей формировался быстрее.
Ось У – Размер проростка в % от контроля.
Ось Х – концентрация нитрата свинца в растворе.
Размер проростков люцерны в зависимости от концентрации нитрата свинца в растворе.
Сравнение трех сортов. (П-88 M. varia, П-66 M. glutinosa, Т-425 M. falcata).
На 5 день.
4. При этом образование каллуса наиболее быстро шло у П-88. Для дальнейшего культивирования отбирали эмбриогенные каллусы.
5. Соотношения между линиями по устойчивости сохраняются in vitro. Дозовые кривые каллусов практически совпадают с графиками энергии прорастания. Наибольшую устойчивость имеет П-66, наименьшую Т-425, максимальное различие между линиями наблюдается на концентрации 0,4%. Полулетальной концентрацией для П-88 и Т-425 оказалась 0,4, для П-66 – 0,6%. Для селекции предполагается использовать среду, содержащую 0,6% нитрата свинца.
Ось У – процент выживания каллусов.
Ось Х – концентрация нитрата свинца в среде.
Дозовые кривые выживаемости каллусов в зависимости от концентрации нитрата свинца в среде.
Сравнение трех сортов. (П-88 M. varia, П-66 M. glutinosa, Т-425 M. falcatа).
6. По интенсивности прорастания и активности роста кукуруза более устойчива, чем люцерна. При дозе Pb(NO3)2 1% всхожесть сохранялась у 40% семян.
Ось У – процент прорастания.
Ось Х – концентрация нитрата свинца в растворе.
Всхожесть кукурузы в зависимости от концентрации нитрата свинца в растворе.
Сравнение двух линий (91 и 188). На 5 день.
7. Размер проростков кукурузы при концентрации 1% у обеих линий составил 18% от контроля.
Ось У – Размер проростков в % от контроля.
Ось Х – концентрация нитрата свинца в растворе.
Размер проростков кукурузы в зависимости от концентрации нитрата свинца в растворе.
Сравнение двух линий (91 и 188). На 5 день.
8. В то же время каллусы кукурузы оказались очень чувствительными, полулетальная концентрация равнялась 0,2%. Это подтверждает сведения из различных изданий о том, что механизмы устойчивости кукурузы к тяжелым металлам связаны с барьерной функцией ризодермы. У люцерны механизмы устойчивости связаны с наружной клеточной мембраной.
Выводы:
1.Полученные данные о положительной корреляции между устойчивостью к соли свинца у растений и культивированием клеток люцерны указывают на целесообразность использования клеточной селекции для получения толерантных растений. Отбор in vitro для кукурузы, вероятно, будет неэффективен.
2.Растения адаптируются к избыткам металлов следующими способами:
- Задерживают ТМ за пределами метаболически важных органов;
- Снижают активность избыточных ионов, переводя их в физиологически инертные формы;
- Создают альтернативные реакции обмена.
3.При селекции in vitro очень часто не удается регенерировать растения из устойчивых клонов, это происходит из-за длительного пассирования тканей, применения стрессовых факторов и мутагенов. Тем не менее, известно довольно много примеров получения путем клеточной селекции солеустойчивых растений.
| 
